Mga pamamaraan para sa paghihiwalay ng isang purong kultura ng pathogen. Pagpapasiya ng bilang ng mga selula sa pamamagitan ng pagtatanim sa solid nutrient media (paraan ng Koch plate)

Pasteur method Koch method Biological Physical

(may historikal (lamellar)

ibig sabihin) mga kable) Paraan ng Kemikal ng Shchukevich

Moderno

Paghahasik gamit ang isang loop Paghahasik gamit ang isang spatula

(Paraan ng Drigalski)

Mga pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga purong kultura (Skema 11):

1. Mga pamamaraan ng mekanikal na pagpapalabas ay batay sa paghihiwalay ng mga mikrobyo sa pamamagitan ng sunud-sunod na pagkuskos ng materyal sa pagsubok sa ibabaw ng isang agar.

A) Pamamaraan ni Pasteur– may makasaysayang kahalagahan, nagbibigay para sa sunud-sunod na pagbabanto ng materyal sa pagsubok sa isang likidong nutrient medium gamit ang rolling method

b) Pamamaraan ng Koch– paraan ng plato – batay sa sunud-sunod na pagbabanto ng materyal na pansubok na may meat-peptone agar, na sinusundan ng pagbuhos ng mga test tube na may diluted na materyal sa mga Petri dish

V) Pamamaraan ng Drigalski– kapag naghahasik ng materyal na kontaminado ng microflora, gumamit ng 2-3 tasa para sa sunud-sunod na paghahasik gamit ang spatula.

G) Paghahasik gamit ang isang loop sa parallel stroke.

2. Mga pamamaraang biyolohikal batay sa mga biological na katangian ng mga pathogen.

A) Biyolohikal– impeksyon ng mga hayop na napakasensitibo, kung saan ang mga mikrobyo ay mabilis na dumami at nag-iipon. Sa ilang mga kaso, ang pamamaraang ito ay ang isa lamang na nagpapahintulot sa paghiwalay ng kultura ng pathogen mula sa isang taong may sakit (halimbawa, sa tularemia), sa ibang mga kaso ito ay mas sensitibo (halimbawa, paghiwalayin ang pneumococcus sa mga puting daga o ang causative agent. ng tuberculosis sa guinea pig).

b) Kemikal– batay sa acid resistance ng mycobacteria. Upang palayain ang materyal mula sa kasamang flora, ito
ginagamot sa acid solution. Tanging ang tuberculosis bacilli ay lalago, dahil ang mga microbes na lumalaban sa acid ay namatay sa ilalim ng impluwensya ng acid.

V) Pisikal na pamamaraan batay sa paglaban ng mga spores sa init. Upang ihiwalay ang isang kultura ng spore-forming bacteria mula sa
mixtures, ang materyal ay pinainit sa 80°C at inoculated sa isang nutrient medium. Tanging ang spore bacteria lamang ang lalago, dahil ang kanilang mga spore ay nanatiling buhay at nagbunga ng paglaki.

G) Pamamaraan ng Shchukevich– ay batay sa mataas na mobility ng Proteus vulgaris, na may kakayahang gumawa ng gumagapang na paglaki.

Paraan ng muling pagtatanim mula sa mga kolonya papunta sa slanted agar at MPB:

A) Paglipat mula sa mga kolonya patungo sa agar slants

Buksan ang takip ng pinggan nang bahagya, alisin ang bahagi ng isang hiwalay na kolonya na may calcined, cooled loop, buksan ang isang test tube na may sterile slanted agar, hawak ito sa iyong kaliwang kamay sa isang hilig na posisyon, upang maobserbahan mo ang ibabaw ng daluyan. Ilipat ang loop na may kultura sa test tube nang hindi hinahawakan ang mga dingding, kuskusin ito sa nutrient medium, dumudulas sa ibabaw mula sa isang gilid ng test tube patungo sa isa pa, itinaas ang mga stroke sa tuktok ng medium - streak seeding. Ang test tube ay sarado at, nang hindi binibitawan, ang pangalan ng inoculated microbe at ang petsa ng inoculation ay nilagdaan.

b) Paglilipat mula sa kolonya patungo sa sabaw ng karne-peptone

Ang pamamaraan para sa reseeding sa MPB ay karaniwang kapareho ng kapag naghahasik sa solid media. Kapag naghahasik sa MPB, ang loop na may materyal dito ay nahuhulog sa daluyan. Kung ang materyal ay malapot at hindi maalis sa loop, ito ay ipapahid sa dingding ng sisidlan at pagkatapos ay hugasan ng isang likidong daluyan. Ang likidong materyal, na nakolekta gamit ang isang sterile Pasteur o graduated pipette, ay ibinubuhos sa nutrient medium.

Bilang resulta ng malayang gawain, dapat malaman ng mag-aaral:

1. Mga pamamaraan para sa paghihiwalay ng isang purong kultura ng mga mikroorganismo

2. Mga pamamaraan para sa paglinang ng mga mikroorganismo

Magagawang:

1. Mga kasanayan sa pagsunod sa mga patakaran ng rehimeng anti-epidemya at mga pag-iingat sa kaligtasan

2. Disimpektahin ang materyal, disimpektahin ang mga kamay

3. Maghanda ng mga paghahanda mula sa bacterial colonies

4. Mga kolonya ng mikroskopya

5. Gram stain microorganisms

ARALIN 8

PAKSANG-ARALIN. Mga pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga dalisay na kultura (ipinagpapatuloy). Enzymatic na aktibidad ng bakterya at mga pamamaraan para sa pag-aaral nito.

Kung, batay sa ilang mga sintomas sa mga halaman at ang mga resulta ng mikroskopikong pagsusuri, pinaghihinalaang ang causative agent ng sakit ay isang bacterium, ang susunod na hakbang ay dapat na ihiwalay ito.

Sa kasong ito, ipinapalagay na ang pathogen ay nahawahan sa mga kasamang organismo, ibig sabihin, mayroong isang halo-halong populasyon. Upang makuha ang pathogen sa anyo ng isang hiwalay na lumalagong kolonya, ang tissue macerate ay dapat na guhitan sa daluyan.

Paghahasik na may haplos. Gamit ang calcined inoculation loop, kumuha ng kaunting tissue ng halaman na macerate na naglalaman ng bacteria at, na may magaan na paggalaw, nang hindi nasisira ang ibabaw ng agar, ilapat ang 4-6 na stroke sa inihandang nutrient medium. Ang pagkakaroon ng muling pag-calcine ng loop, ang tasa na may daluyan ay nakabukas sa 90 ° sa kanan at pagkatapos ay isa pang 4-6 na stroke ay inilapat mula sa pangalawang stroke, ang karayom ​​ay muling na-calcine at ang ikatlong paghahasik ay isinasagawa. Nakakamit nito ang pagbabanto ng panimulang materyal upang ang bakterya, pagkatapos ng pagpapapisa ng itlog sa isang termostat sa loob ng 48-72 oras sa 28 °C, ay bumubuo ng mga indibidwal na kolonya ng iba't ibang mga hugis at kulay. Ang mga kolonya ay pagkatapos ay inilipat sa agar slant tubes para sa karagdagang pagsusuri. Gamit ang calcined loop, kumuha ng kolonya at ilapat ito sa nutrient agar na may maingat na paggalaw sa anyo ng isang ahas o zigzag.

Paraan ng pagbuhos ng Koch. Tinitiyak ng paraan ng Koch plate na ang bawat kolonya ay nabuo mula sa isang cell ng bacterial. Pinakamainam na maghanda ng isang suspensyon mula sa panimulang materyal sa sterile na tubig at gamitin ang paraan ng Koch lamang sa pagbabanto na ito. Ang isang maliit na halaga ng suspensyon ay inilipat sa unang test tube na may nutrient medium na pinalamig hanggang 60 °C. Pagkatapos ang mga nilalaman ng tubo ay halo-halong may inoculum sa pamamagitan ng pag-ikot nito sa pagitan ng mga palad. Susunod, kumuha ng pangalawang test tube, maingat na buksan ito sa ibabaw ng apoy ng burner, at gumamit ng malalaking loop upang ilipat ang tatlong bahagi ng substrate papunta dito mula sa unang test tube. Pagkatapos ng pagpapaputok sa leeg at stopper, ang mga nilalaman ng test tube ay ibinubuhos sa unang Petri dish, na binubuksan ang takip ng pinggan na sapat lamang upang maipasok ang leeg ng test tube sa ilalim nito. Kaagad pagkatapos ibuhos, isara ang tasa at maingat na ipamahagi ang nutrient medium nang pantay-pantay.

Ang pagkakaroon ng lubusan na paghahalo ng mga nilalaman ng pangalawang test tube, kumuha ng ikatlong test tube at ilipat ang anim na bahagi ng substrate mula sa pangalawa papunta dito gamit ang isang loop. Ang mga nilalaman ng test tube ay ibinubuhos sa isang tasa, at ang mga nilalaman ng test tube, pagkatapos ng paghahalo, ay ibinuhos sa tasa. Ang mga pinggan na may medium ay inilubog sa isang termostat sa 28°C; pagkalipas ng ilang araw, ang mga bakterya na nasa panimulang materyal ay bumubuo ng mga kolonya.

Serial breeding. Kung, halimbawa, kinakailangan na ihiwalay ang bakterya mula sa lupa, pagkatapos ay ginagamit ang serial dilution. Ang sterile nutrient medium (15 ml bawat tasa) ay ibinuhos sa mga tasa, 0.1 ml ng huling tatlong dilutions ng suspensyon ay inilapat sa hardened agar at kumalat sa ibabaw na may isang glass spatula.

Upang ihiwalay ang bakterya, 1 g ng lupa ay sinuspinde sa 9 ML ng tubig, inalog ng mabuti, pinapayagan na manirahan ng ilang segundo, at ang mga serial dilution ay inihanda mula sa suspensyon. Gamit ang pamamaraang ito, maaaring matukoy ang bilang ng mga mikroorganismo sa bawat sample.

Kung makakita ka ng error, mangyaring i-highlight ang isang piraso ng teksto at i-click Ctrl+Enter.

77288 0

Mga kultural na katangian ng bakterya

Ang kolonya ay isang nakahiwalay na koleksyon ng mga cell ng parehong uri na lumago mula sa isang cell (clone ng mga cell). Depende sa kung saan lumalaki ang microorganism (sa ibabaw ng isang siksik na nutrient medium o sa kapal nito), ang ibabaw, malalim at ilalim na mga kolonya ay nakikilala.

Ang mga kolonya na lumaki sa ibabaw ng daluyan ay magkakaiba: sila ay partikular sa mga species at ang kanilang pag-aaral ay ginagamit upang matukoy ang mga species ng pananim na pinag-aaralan.

Kapag naglalarawan ng mga kolonya, ang mga sumusunod na katangian ay isinasaalang-alang:
1) ang hugis ng kolonya - bilog, amoeboid, rhizoid, irregular, atbp.;

2) laki (diameter) ng kolonya - napakaliit (pointed) (0.1-0.5 mm), maliit (0.5-3 mm), medium-sized (3-5 mm) at malaki (higit sa 5 mm ang lapad );

3) ang ibabaw ng kolonya ay makinis, magaspang, nakatiklop, kulubot, may concentric na bilog o radially striated;

4) profile ng kolonya - flat, convex, cone-shaped, crater-shaped, atbp.;

5) transparency - mapurol, matte, makintab, transparent, pulbos;

6) kulay ng kolonya (pigment) - walang kulay o pigmented (puti, dilaw, ginintuang, pula, itim), lalo na tandaan ang paglabas ng pigment sa daluyan kasama ang pangkulay nito;

7) gilid ng kolonya - makinis, kulot, tulis-tulis, palawit, atbp.;

8) istraktura ng kolonya - homogenous, pino o magaspang na butil, may bahid; ang gilid at istraktura ng kolonya ay natutukoy gamit ang isang magnifying glass o sa mababang pag-magnify ng isang mikroskopyo sa pamamagitan ng paglalagay ng isang Petri dish na may inoculation sa mesa ng mikroskopyo na may takip;

9) pagkakapare-pareho ng kolonya; tinutukoy sa pamamagitan ng pagpindot sa ibabaw gamit ang isang loop: ang kolonya ay maaaring siksik, malambot, lumalaki sa agar, mauhog (lumalawak sa likod ng loop), marupok (madaling masira kapag nakikipag-ugnay sa loop).

Ang mga malalalim na kolonya ay kadalasang mukhang mas marami o hindi gaanong mga pipit na lentil (hugis na hugis-itlog na may matulis na dulo), kung minsan ay mga bukol ng cotton wool na may parang sinulid na mga bunga sa nutrient medium. Ang pagbuo ng malalim na mga kolonya ay madalas na sinamahan ng pagkalagot ng siksik na daluyan kung ang mga mikroorganismo ay naglalabas ng gas.

Ang mga kolonya sa ibaba ay karaniwang mukhang manipis na transparent na mga pelikula na kumakalat sa ilalim.

Ang mga katangian ng kolonya ay maaaring magbago sa edad, depende sila sa komposisyon ng daluyan at temperatura ng paglilinang.

Ang paglaki ng mga mikroorganismo sa likidong nutrient media ay isinasaalang-alang gamit ang apat hanggang pitong araw na kultura na lumago sa ilalim ng mga nakatigil na kondisyon.

Sa likidong nutrient media, kasama ang paglaki ng mga microorganism, ang labo ng medium at ang pagbuo ng isang pelikula o sediment ay sinusunod.

Kapag lumalaki sa semi-liquid (0.5-0.7% agar) nutrient media, ang mga mobile microbes ay nagdudulot ng malinaw na labo, ang mga immobile na form ay lumalaki lamang sa panahon ng paghahasik sa pamamagitan ng iniksyon sa daluyan.

Kadalasan ang paglaki ng mga mikrobyo ay sinamahan ng hitsura ng amoy, pigmentation ng kapaligiran, at paglabas ng gas. Ang katangian ng amoy ng mga kultura ng ilang uri ng bakterya ay nauugnay sa pagbuo ng iba't ibang mga ester (ethyl acetate, amyl acetate, atbp.), Indole, mercaptan, hydrogen sulfide, skatole, ammonia, butyric acid.

Ang kakayahang bumuo ng mga pigment ay likas sa maraming uri ng mga mikroorganismo. Ang kemikal na katangian ng mga pigment ay magkakaiba: carotenoids, anthocyanin, melanins. Kung ang pigment ay hindi matutunaw sa tubig, ang kultural na plaka lamang ang nabahiran; kung ito ay natutunaw, ang nutrient medium ay nagiging kulay din. Ito ay pinaniniwalaan na ang mga pigment ay nagpoprotekta sa bakterya mula sa mga nakakapinsalang epekto ng sikat ng araw, kaya naman napakaraming pigmented bacteria sa hangin; bilang karagdagan, ang mga pigment ay kasangkot sa metabolismo ng mga microorganism na ito.

Sa kalikasan, may mga tinatawag na phosphorescent bacteria, ang mga kultura na kumikinang sa dilim na may maberde-maasul o madilaw-dilaw na liwanag. Ang ganitong mga bakterya ay matatagpuan pangunahin sa tubig ng ilog o dagat. Luminous bacteria - photobacteria - kasama ang aerobic bacteria (vibrios, cocci, rods).

Paghihiwalay ng mga purong kultura ng mga mikroorganismo

Ang materyal na pinag-aaralan (tubig, lupa, hangin, pagkain o iba pang bagay) ay karaniwang naglalaman ng mga asosasyon ng mga mikrobyo.

Ang paghihiwalay ng isang purong kultura ay ginagawang posible na pag-aralan ang morphological, kultural, biochemical, antigenic at iba pang mga katangian, ang kabuuan nito ay tumutukoy sa mga species at uri ng pathogen, ibig sabihin, ang pagkakakilanlan nito ay ginawa.

Upang ihiwalay ang mga purong kultura ng mga mikroorganismo, ginagamit ang mga pamamaraan na maaaring nahahati sa maraming grupo:
1. Pamamaraan ni Pasteur - sunud-sunod na pagbabanto ng materyal sa pagsubok sa isang likidong nutrient medium sa konsentrasyon ng isang cell sa volume (may historikal na kahalagahan).

2. Paraan ng Koch ("mga kable ng plato") - sunud-sunod na pagbabanto ng materyal sa pagsubok sa molten agar (temperatura 48-50 C), na sinusundan ng pagbuhos sa mga pagkaing Petri, kung saan ang agar ay nagpapatigas. Ang mga inoculation ay ginawa, bilang panuntunan, mula sa huling tatlo o apat na pagbabanto, kung saan ang bakterya ay nagiging kaunti at kalaunan, habang lumalaki sila sa mga pagkaing Petri, lumilitaw ang mga nakahiwalay na kolonya, na nabuo mula sa isang paunang selula ng ina. Mula sa mga nakahiwalay na kolonya na malalim sa agar, ang isang purong kultura ng bakterya ay nakuha sa pamamagitan ng subculture papunta sa sariwang media.

3. Paraan ng Shukevich - ginagamit upang makakuha ng isang purong kultura ng Proteus at iba pang mga microorganism na may "gumagapang" na paglaki. Ang pagsubok na materyal ay inoculated sa condensation tubig sa base ng agar slant. Ang mga mobile microbes (Proteus) ay nagagawang tumaas ang slanted agar, ang mga immobile na form ay nananatiling tumubo sa ibaba, sa lugar ng paghahasik. Sa pamamagitan ng muling pagtatanim sa itaas na mga gilid ng kultura, maaari kang makakuha ng isang purong kultura.

4. Drigalsky method - malawakang ginagamit sa bacteriological practice, kung saan ang materyal na pinag-aaralan ay diluted sa isang test tube na may sterile saline solution o sabaw. Ang isang patak ng materyal ay idinagdag sa unang tasa at kumalat sa ibabaw ng daluyan gamit ang isang sterile glass spatula. Pagkatapos, gamit ang parehong spatula (nang hindi sinusunog ito sa apoy ng burner), ang parehong paghahasik ay ginagawa sa pangalawa at pangatlong tasa.

Sa bawat pagbabakuna ng bakterya, mas kaunti ang nananatili sa spatula at, kapag naghahasik sa ikatlong tasa, ang bakterya ay ipapamahagi sa ibabaw ng nutrient medium nang hiwalay sa isa't isa. Pagkatapos ng 1-7 araw ng pag-imbak ng mga pinggan sa isang termostat (depende sa rate ng paglago ng mga microorganism), sa ikatlong ulam, ang bawat bacterium ay gumagawa ng isang clone ng mga cell, na bumubuo ng isang nakahiwalay na kolonya, na subcultured sa slanted agar upang maipon. isang purong kultura.

5. Pamamaraan ng Weinberg. Ang mga partikular na paghihirap ay lumitaw kapag ihiwalay ang mga purong kultura ng obligadong anaerobes. Kung ang pakikipag-ugnay sa molekular na oxygen ay hindi agad na nagiging sanhi ng pagkamatay ng cell, kung gayon ang pagtatanim ay isinasagawa ayon sa pamamaraan ng Drigalsky, ngunit pagkatapos nito ang mga pinggan ay agad na inilalagay sa isang anaerostat. Gayunpaman, ang paraan ng pag-aanak ay mas madalas na ginagamit. Ang kakanyahan nito ay nakasalalay sa katotohanan na ang pagbabanto ng materyal sa ilalim ng pag-aaral ay isinasagawa sa isang tinunaw at pinalamig sa 45-50 oC agar nutrient medium.

Ang 6-10 na sunud-sunod na pagbabanto ay ginawa, pagkatapos ay ang daluyan sa mga test tube ay mabilis na pinalamig at ang ibabaw ay natatakpan ng isang layer ng pinaghalong paraffin at petroleum jelly upang maiwasan ang hangin na tumagos sa kapal ng nutrient medium. Minsan ang nutrient medium, pagkatapos ng paghahasik at paghahalo, ay inililipat sa sterile Burri tubes o capillary Pasteur pipettes, ang mga dulo nito ay selyadong. Sa matagumpay na pagbabanto, ang mga nakahiwalay na kolonya ng anaerobes ay lumalaki sa mga tubo ng pagsubok, mga tubo ng Burri, at mga pipette ng Pasteur. Upang matiyak na malinaw na nakikita ang mga nakahiwalay na kolonya, ginagamit ang nilinaw na nutrient media.

Upang kunin ang mga nakahiwalay na kolonya ng anaerobes, ang tubo ay bahagyang pinainit sa pamamagitan ng pag-ikot nito sa ibabaw ng apoy, habang ang agar na katabi ng mga dingding ay natutunaw at ang mga nilalaman ng tubo sa anyo ng isang haligi ng agar ay dumudulas sa isang sterile na Petri dish. Ang haligi ng agar ay pinutol gamit ang mga sterile tweezers at ang mga kolonya ay tinanggal gamit ang isang loop. Ang mga nakuhang kolonya ay inilalagay sa isang likidong daluyan na paborable para sa pagbuo ng mga nakahiwalay na mikroorganismo. Ang agar medium ay tinatangay ng hangin mula sa Burri tube sa pamamagitan ng pagpasa ng gas sa pamamagitan ng isang cotton plug.

6. Hungate na paraan. Kapag gusto nilang makakuha ng mga nakahiwalay na kolonya ng bakterya na may partikular na mataas na sensitivity sa oxygen (mahigpit na aerobes), ginagamit ang paraan ng Hungate rotating tube. Upang gawin ito, ang molten agar medium ay inoculated na may bacteria sa isang pare-parehong kasalukuyang sa pamamagitan ng isang test tube ng inert gas na napalaya mula sa oxygen impurities. Ang tubo ay pagkatapos ay tinatakan ng isang goma na takip at inilagay nang pahalang sa isang clamp na umiikot sa tubo; ang daluyan ay pantay na ipinamamahagi sa mga dingding ng test tube at nagpapatigas sa isang manipis na layer. Ang paggamit ng manipis na layer sa isang test tube na puno ng gas mixture ay nagbibigay-daan sa isa na makakuha ng mga hiwalay na kolonya na malinaw na nakikita ng mata.

7. Paghihiwalay ng mga indibidwal na selula gamit ang isang micromanipulator. Ang micromanipulator ay isang aparato na nagbibigay-daan sa iyong alisin ang isang cell mula sa isang suspensyon gamit ang isang espesyal na micropipette o microloop. Ang operasyong ito ay kinokontrol sa ilalim ng mikroskopyo. Ang isang basa-basa na silid ay naka-install sa yugto ng mikroskopyo, kung saan inilalagay ang paghahanda ng hanging drop. Ang mga micropipettes (micropoops) ay naayos sa mga may hawak ng mga operating stand, ang paggalaw kung saan sa larangan ng view ng mikroskopyo ay isinasagawa nang may katumpakan ng micron salamat sa isang sistema ng mga turnilyo at levers. Ang mananaliksik, na tumitingin sa isang mikroskopyo, ay nag-aalis ng mga indibidwal na selula na may micropipettes at inililipat ang mga ito sa mga tubo na naglalaman ng isang sterile na likidong daluyan upang makakuha ng cell clone.

L.V. Timoschenko, M.V. Chubik

Mga espesyal na kapaligiran.

Sa bacteriology, ang dry nutrient media na ginawa ng industriya ay malawakang ginagamit, na mga hygroscopic powder na naglalaman ng lahat ng bahagi ng medium maliban sa tubig. Para sa kanilang paghahanda, ginagamit ang mga tryptic digest ng murang mga produktong hindi pagkain (basura ng isda, karne at pagkain ng buto, teknikal na casein). Ang mga ito ay maginhawa para sa transportasyon, maaaring maimbak nang mahabang panahon, mapawi ang mga laboratoryo mula sa napakalaking proseso ng paghahanda ng media, at ilapit sila sa paglutas sa isyu ng standardisasyon ng media. Ang industriya ng medikal ay gumagawa ng dry media na Endo, Levin, Ploskirev, bismuth sulfite agar, nutrient agar, carbohydrates na may BP indicator at iba pa.

Mga thermostat

Ang mga thermostat ay ginagamit para sa paglilinang ng mga mikroorganismo.

Ang thermostat ay isang device na nagpapanatili ng pare-parehong temperatura. Ang aparato ay binubuo ng isang pampainit, silid, dobleng dingding, sa pagitan ng kung saan ang hangin o tubig ay nagpapalipat-lipat. Ang temperatura ay kinokontrol ng isang termostat. Ang pinakamainam na temperatura para sa pagpaparami ng karamihan sa mga microorganism ay 37°C.

ARALIN 7

PAKSANG-ARALIN: MGA PARAAN PARA SA PAG-ISOLATE NG PURE CULTURE NG AEROBES. MGA HAKBANG NG ISOLATION NG PURE CULTURE NG AEROBIC BACTERIA SA MECHANICAL DISSOCIATION METHOD

Lesson plan

1. Ang konsepto ng "purong kultura" ng bakterya

2. Mga pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga purong kultura sa pamamagitan ng mekanikal na paghihiwalay

3. Biyolohikal na pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga dalisay na kultura

4. Mga pamamaraan para sa pagtukoy ng bakterya

Layunin ng aralin: Upang ipaalam sa mga mag-aaral ang iba't ibang paraan ng paghihiwalay ng mga dalisay na kultura, upang turuan kung paano maghasik gamit ang isang loop, stroke, at isang iniksyon.

Mga patnubay para sa demonstrasyon

Sa kanilang likas na tirahan, ang bakterya ay matatagpuan sa mga asosasyon. Upang matukoy ang mga katangian ng microbes at ang kanilang papel sa pagbuo ng proseso ng pathological, kinakailangan na magkaroon ng bakterya sa anyo ng mga homogenous na populasyon (purong kultura). Ang purong kultura ay isang koleksyon ng mga bacterial na indibidwal ng parehong species na lumago sa isang nutrient medium.

Mga pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga purong kultura ng aerobic bacteria

Pasteur method Koch method Biological Physical

(may historical (plate wiring)

kahulugan)

Paraan ng Kemikal

Shchukevich

Moderno

Paghahasik gamit ang isang loop Paghahasik gamit ang isang spatula

(Paraan ng Drigalski)

Mga pamamaraan para sa paghihiwalay ng mga purong kultura:

1. Ang mga mekanikal na paraan ng paghihiwalay ay batay sa paghihiwalay ng mga mikrobyo sa pamamagitan ng sunud-sunod na pagkuskos ng materyal sa pagsubok sa ibabaw ng agar.

a) Paraan ng Pasteur - ay may makasaysayang kahalagahan, nagbibigay para sa sunud-sunod na pagbabanto ng materyal sa pagsubok sa isang likidong nutrient medium sa pamamagitan ng rolling method

b) Ang pamamaraan ni Koch - ang plate method - ay batay sa sequential dilution ng test material na may meat peptone agar, na sinusundan ng pagbuhos ng mga test tube na may diluted na materyal sa mga Petri dish.

c) Pamamaraan ng Drigalsky - kapag naghahasik ng materyal na maraming binhi na may microflora, gumamit ng 2-3 tasa para sa sunud-sunod na paghahasik gamit ang isang spatula.

d) Paghahasik gamit ang isang loop sa parallel stroke.

2. Ang mga biological na pamamaraan ay batay sa mga biological na katangian ng mga pathogen.

a) Biyolohikal - impeksiyon ng mga hayop na napakasensitibo, kung saan ang mga mikrobyo ay mabilis na dumami at nag-iipon. Sa ilang mga kaso, ang pamamaraang ito ay ang isa lamang na nagpapahintulot sa isa na ihiwalay ang kultura ng pathogen mula sa isang taong may sakit (halimbawa, may tularemia), sa ibang mga kaso ito ay mas sensitibo (halimbawa, ang paghihiwalay ng pneumococcus sa mga puting daga o ang pathogen ng tuberculosis sa guinea pig).

b) Kemikal - batay sa acid resistance ng mycobacteria. Upang palayain ang materyal mula sa kasamang flora, ito
ginagamot sa acid solution. Tanging ang tuberculosis bacilli ay lalago, dahil ang mga microbes na lumalaban sa acid ay namatay sa ilalim ng impluwensya ng acid.

c) Ang pisikal na pamamaraan ay batay sa paglaban ng mga spores sa init. Upang ihiwalay ang isang kultura ng spore-forming bacteria mula sa
mixtures, ang materyal ay pinainit sa 80°C at inoculated sa isang nutrient medium. Tanging ang spore bacteria lamang ang lalago, dahil ang kanilang mga spore ay nanatiling buhay at nagbunga ng paglaki.

d) Paraan ni Shchukevich - batay sa mataas na kadaliang mapakilos ng Proteus vulgaris, na may kakayahang gumawa ng gumagapang na paglaki.

Paraan para sa paghahanda ng plate agar

Ang MPA ay natutunaw sa isang paliguan ng tubig, pagkatapos ay pinalamig sa 50-55°C. Ang leeg ng bote ay sinusunog sa apoy ng isang lampara ng alkohol, ang mga pinggan ng Petri ay binuksan upang ang leeg ng bote ay magkasya nang hindi hawakan ang mga gilid ng pinggan, 10-15 ml ng MPA ay ibinuhos, ang takip ay sarado, ang ulam ay inalog upang ang daluyan ay pantay na ipinamamahagi, at iniwan sa isang pahalang na ibabaw hanggang sa ito ay tumigas. Pagkatapos matuyo, ang mga plate agar plate ay iniimbak sa malamig.

Paghahasik ng loop

Gamit ang isang sterile cooled loop, kumuha ng isang patak ng materyal, buksan ang isang gilid ng tasa gamit ang iyong kaliwang kamay, dalhin ang loop sa loob at gumawa ng ilang stroke sa isang lugar na may loop sa kabaligtaran na gilid, pagkatapos ay tanggalin ang loop at inoculate ang materyal sa parallel stroke mula sa isang gilid ng tasa sa isa na may pagitan ng 5-6 mm. Sa simula ng paghahasik, kapag mayroong maraming mikrobyo sa loop, magbibigay sila ng magkakaugnay na paglaki, ngunit sa bawat stroke mayroong mas kaunti at mas kaunting mga mikrobyo sa loop, at mananatili silang nag-iisa at gumagawa ng mga nakahiwalay na kolonya.

Paghahasik ayon sa pamamaraan ng Drigalsky

Ang pamamaraang ito ay ginagamit kapag inoculating ang materyal na labis na kontaminado ng microflora (pus, feces, plema). Upang maghasik gamit ang pamamaraang Drigalsky, kumuha ng spatula at ilang tasa (3-4). Ang spatula ay isang tool na gawa sa metal wire o glass dart, na nakatungo sa isang tatsulok o L-shape. Ang materyal ay ipinakilala sa unang tasa na may isang loop o pipette at pantay na ipinamahagi gamit ang isang spatula sa ibabaw ng daluyan; na may parehong spatula, nang hindi sinusunog ito, ang materyal ay ipinahid sa nutrient medium sa pangalawang tasa, at pagkatapos sa pangatlo. Sa ganitong paghahasik, ang unang tasa ay magkakaroon ng magkakaugnay na paglaki, at ang mga nakahiwalay na kolonya ay lalago sa mga susunod na tasa.

Pangunahing yugto sa pagbuo ng microbiology, virology at immunology

Kabilang dito ang mga sumusunod:

1.Empirical na kaalaman(bago ang pag-imbento ng mga mikroskopyo at ang kanilang paggamit para sa pag-aaral ng microworld).

Iminungkahi ni J. Fracastoro (1546) ang buhay na kalikasan ng mga ahente ng mga nakakahawang sakit - contagium vivum.

2.Panahon ng morpolohiya umabot ng halos dalawang daang taon.

Antonie van Leeuwenhoek noong 1675 unang inilarawan ang protozoa, noong 1683 - ang mga pangunahing anyo ng bakterya. Ang di-kasakdalan ng mga instrumento (ang pinakamataas na pag-magnify ng X300 na mga mikroskopyo) at mga pamamaraan para sa pag-aaral ng microworld ay hindi nag-ambag sa mabilis na akumulasyon ng siyentipikong kaalaman tungkol sa mga mikroorganismo.

3.Panahon ng pisyolohikal(mula noong 1875) - ang panahon ni L. Pasteur at R. Koch.

L. Pasteur - pag-aaral ng mga microbiological na pundasyon ng mga proseso ng fermentation at pagkabulok, pag-unlad ng pang-industriyang microbiology, pagpapaliwanag ng papel ng mga microorganism sa sirkulasyon ng mga sangkap sa kalikasan, pagtuklas anaerobic microorganism, pag-unlad ng mga prinsipyo asepsis, paraan isterilisasyon, nanghihina ( pagpapahina)virulence at pagtanggap mga bakuna (mga strain ng bakuna).

R. Koch - paraan ng paghihiwalay mga dalisay na kultura sa solid nutrient media, mga paraan ng paglamlam ng bakterya na may aniline dyes, pagtuklas ng mga sanhi ng anthrax, cholera ( Koch comma), tuberkulosis (Tumayo si Koch), pagpapabuti ng mga pamamaraan ng mikroskopya. Pang-eksperimentong pagpapatunay ng pamantayan ng Henle, na kilala bilang ang Henle-Koch postulates (triad).

4.Immunological period.

Si I.I. Mechnikov ay ang "makata ng microbiology" ayon sa makasagisag na kahulugan ni Emil Roux. Lumikha siya ng isang bagong panahon sa microbiology - ang doktrina ng kaligtasan sa sakit (immunity), pagbuo ng teorya ng phagocytosis at pagpapatunay ng cellular theory ng immunity.

Kasabay nito, ang data sa produksyon sa katawan ay naipon antibodies laban sa bakterya at kanilang lason, na nagpapahintulot kay P. Ehrlich na bumuo ng humoral na teorya ng kaligtasan sa sakit. Sa kasunod na pangmatagalan at mabungang talakayan sa pagitan ng mga tagasuporta ng phagocytic at humoral theories, maraming mekanismo ng immunity ang nahayag at ipinanganak ang agham. immunology.

Nang maglaon, natagpuan na ang namamana at nakuha na kaligtasan sa sakit ay nakasalalay sa pinagsama-samang aktibidad ng limang pangunahing sistema: macrophage, complement, T- at B-lymphocytes, interferon, ang pangunahing histocompatibility system, na nagbibigay ng iba't ibang anyo ng immune response. I.I. Mechnikov at P. Erlich noong 1908. iginawad ang Nobel Prize.

Pebrero 12, 1892 Sa isang pulong ng Russian Academy of Sciences, iniulat ni D.I. Ivanovsky na ang causative agent ng tobacco mosaic disease ay isang filterable virus. Ang petsang ito ay maaaring ituring na isang kaarawan virology, at si D.I. Ivanovsky ang nagtatag nito. Kasunod nito, lumabas na ang mga virus ay nagdudulot ng mga sakit hindi lamang sa mga halaman, kundi pati na rin sa mga tao, hayop at maging bakterya. Gayunpaman, pagkatapos lamang maitatag ang likas na katangian ng gene at genetic code, ang mga virus ay inuri bilang nabubuhay na kalikasan.

5. Ang susunod na mahalagang yugto sa pagbuo ng microbiology ay pagtuklas ng antibiotics. Noong 1929 A. Natuklasan ni Fleming ang penicillin at nagsimula ang panahon ng antibiotic therapy, na humahantong sa rebolusyonaryong pag-unlad sa medisina. Nang maglaon, lumabas na ang mga mikrobyo ay umaangkop sa mga antibiotic, at ang pag-aaral ng mga mekanismo ng paglaban sa droga ay humantong sa pagtuklas ng isang segundo. extrachromosomal (plasmid) genome bakterya.

Nag-aaral plasmids ay nagpakita na sila ay mas simpleng mga nakabalangkas na organismo kaysa sa mga virus, at hindi katulad mga bacteriophage huwag makapinsala sa bakterya, ngunit bigyan sila ng karagdagang mga biological na katangian. Ang pagtuklas ng mga plasmid ay makabuluhang pinalawak ang pag-unawa sa mga anyo ng pagkakaroon ng buhay at posibleng mga landas ng ebolusyon nito.

6. Moderno yugto ng molekular na genetic Ang pag-unlad ng microbiology, virology at immunology ay nagsimula sa ikalawang kalahati ng ika-20 siglo na may kaugnayan sa mga tagumpay ng genetics at molecular biology, at ang paglikha ng electron microscope.

Napatunayan ng mga eksperimento sa bakterya ang papel ng DNA sa paghahatid ng mga namamana na katangian. Ang paggamit ng bakterya, mga virus, at mga plasmid sa ibang pagkakataon bilang mga bagay ng molecular biology at genetic na pananaliksik ay humantong sa isang mas malalim na pag-unawa sa mga pangunahing proseso na pinagbabatayan ng buhay. Ang paglilinaw ng mga prinsipyo ng pag-encode ng genetic na impormasyon sa bacterial DNA at pagtatatag ng universality ng genetic code ay naging posible upang mas maunawaan ang mga molecular genetic pattern na katangian ng mas mataas na organisadong mga organismo.

Ang pag-decode ng genome ng Escherichia coli ay naging posible upang magdisenyo at maglipat ng mga gene. Sa ngayon Genetic engineering lumikha ng mga bagong direksyon bioteknolohiya.

Ang molekular na genetic na organisasyon ng maraming mga virus at ang mga mekanismo ng kanilang pakikipag-ugnayan sa mga cell ay na-decipher, ang kakayahan ng viral DNA na isama sa genome ng isang sensitibong cell at ang mga pangunahing mekanismo ng viral carcinogenesis ay naitatag.

Ang immunology ay sumailalim sa isang tunay na rebolusyon, na lumampas sa saklaw ng nakakahawang immunology at naging isa sa pinakamahalagang pangunahing medikal at biyolohikal na disiplina. Sa ngayon, ang immunology ay isang agham na nag-aaral hindi lamang proteksyon laban sa mga impeksyon. Sa modernong kahulugan Ang immunology ay isang agham na nag-aaral ng mga mekanismo ng pagtatanggol sa sarili ng katawan mula sa lahat ng genetically foreign, pinapanatili ang istruktura at functional na integridad ng katawan.

Kasalukuyang kasama sa immunology ang ilang espesyal na lugar, kung saan, kasama ng nakakahawang immunology, ang pinakamahalaga ay kinabibilangan ng immunogenetics, immunomorphology, transplantation immunology, immunopathology, immunohematology, oncoimmunology, ontogenesis immunology, vaccinology at inilapat na immunodiagnostics.

Microbiology at virology bilang pangunahing biyolohikal na agham kasama rin ang ilang mga independiyenteng siyentipikong disiplina na may sariling mga layunin at layunin: pangkalahatan, teknikal (pang-industriya), agrikultura, beterinaryo at ang pinakamahalaga para sa sangkatauhan medikal na microbiology at virology.

Ang medikal na microbiology at virology ay pinag-aaralan ang mga sanhi ng mga nakakahawang sakit ng tao (ang kanilang morpolohiya, pisyolohiya, ekolohiya, biological at genetic na mga katangian), bubuo ng mga pamamaraan para sa kanilang paglilinang at pagkakakilanlan, mga tiyak na pamamaraan para sa kanilang pagsusuri, paggamot at pag-iwas.