Hiilidioksidin kulkeutuminen veren mukana. Hiilihappoanhydraasin merkitys

Hiilidioksidi on kudossolujen aineenvaihduntatuote, ja siksi se kulkeutuu veren mukana kudoksista keuhkoihin. Hiilidioksidilla on tärkeä rooli pH-tason ylläpitämisessä kehon sisäisissä ympäristöissä happo-emästasapainomekanismien avulla. Siksi hiilidioksidin kulkeutuminen veressä liittyy läheisesti näihin mekanismeihin.

Veriplasmassa liukenee pieni määrä hiilidioksidia; PC02:ssa = 40 mm Hg. Taide. 2,5 ml/100 ml veren hiilidioksidia siedetään eli 5 %. Plasmaan liuenneen hiilidioksidin määrä kasvaa lineaarisesti PC02-tason kanssa.

Veriplasmassa hiilidioksidi reagoi veden kanssa muodostaen H+ ja HCO3. Hiilidioksidin jännityksen nousu veriplasmassa aiheuttaa sen pH-arvon laskun. Veriplasman hiilidioksidijännitystä voidaan muuttaa ulkoisen hengityksen toiminnan avulla ja vetyionien määrää tai pH:ta voidaan muuttaa veren ja HCO3:n puskurijärjestelmillä, esimerkiksi erittämällä niitä munuaisten kautta virtsa. Veriplasman pH-arvo riippuu siihen liuenneen hiilidioksidin ja bikarbonaatti-ionien pitoisuuden suhteesta. Vetykarbonaatin muodossa veriplasma eli kemiallisesti sitoutuneessa tilassa kuljettaa pääosan hiilidioksidista - noin 45 ml/100 ml verta eli jopa 90 %. Punasolut kuljettavat noin 2,5 ml/100 ml hiilidioksidia eli 5 % karbamiiniyhdisteen muodossa hemoglobiiniproteiinien kanssa. Hiilidioksidin kulkeutuminen veressä kudoksista keuhkoihin osoitetuissa muodoissa ei liity kyllästymisilmiöön, kuten hapen kuljetukseen, eli mitä enemmän hiilidioksidia muodostuu, sitä suurempi määrä sitä siirtyy kudoksia keuhkoihin. Veren hiilidioksidin osapaineen ja veren kuljettaman hiilidioksidin määrän välillä on kuitenkin käyräviivainen suhde: hiilidioksidin dissosiaatiokäyrä.

Hiilianhydraasi. (synonyymi: karbonaattidehydrataasi, karbonaattihydrolyaasi) on entsyymi, joka katalysoi hiilidioksidihydraation palautuvaa reaktiota: CO 2 + H 2 O Û H 2 CO 3 Û H + + HCO 3. Sisältyy punasoluihin, mahalaukun limakalvon soluihin, lisämunuaiskuoreen, munuaisiin ja pieninä määrinä keskushermostoon, haimaan ja muihin elimiin. Hiilihappoanhydraasin rooli kehossa liittyy ylläpitoon happo-emästasapaino, hiilidioksidin kuljetus, suolahapon muodostuminen mahalaukun limakalvon kautta. Hiilihappoanhydraasin aktiivisuus veressä on normaalisti melko vakio, mutta joissakin patologisissa olosuhteissa se muuttuu dramaattisesti. Hlisääntymistä veressä havaitaan eri alkuperän anemiassa, II-III asteen verenkiertohäiriöissä, joissakin keuhkosairauksissa (bronkiektaasi, pneumoskleroosi) sekä raskauden aikana. Tämän entsyymin aktiivisuuden lasku veressä tapahtuu munuaisperäisen asidoosin, kilpirauhasen liikatoiminnan kanssa. Suonensisäisessä hemolyysissä hilmenee virtsassa, kun taas normaalisti se puuttuu. On suositeltavaa seurata hiilihappoanhydraasin aktiivisuutta veressä sydämen ja keuhkojen kirurgisten toimenpiteiden aikana, koska se voi toimia indikaattorina kehon mukautumiskyvystä sekä hoidon aikana hiilihappoanhydraasin estäjillä - hypotiatsidilla, diakarbilla.

Hiilianhydraasi(synonyymi: karbonaattidehydrataasi, karbonaattihydrolyaasi) on entsyymi, joka katalysoi hiilidioksidihydraation palautuvaa reaktiota: CO 2 + H 2 O Û H 2 CO 3 Û H + + HCO 3. Sisältyy punasoluihin, mahalaukun limakalvon soluihin, lisämunuaiskuoreen, munuaisiin ja pieninä määrinä keskushermostoon, haimaan ja muihin elimiin. Hiilihappoanhydraasin rooli kehossa liittyy ylläpitoon happo-emästasapaino, CO 2:n kuljetus, suolahapon muodostuminen mahalaukun limakalvon kautta. Hiilihappoanhydraasin aktiivisuus veressä on normaalisti melko vakio, mutta joissakin patologisissa olosuhteissa se muuttuu dramaattisesti. Hiilihappoanhydraasin aktiivisuuden lisääntymistä veressä havaitaan eri alkuperän anemiassa, II-III asteen verenkiertohäiriöissä, joissakin keuhkosairauksissa (keuhkoputkentulehdus, pneumoskleroosi) sekä raskauden aikana. Tämän entsyymin aktiivisuuden lasku veressä tapahtuu munuaisperäisen asidoosin, kilpirauhasen liikatoiminnan kanssa. Suonensisäisessä hemolyysissä hilmenee virtsassa, kun taas normaalisti se puuttuu. On suositeltavaa seurata hiilihappoanhydraasin aktiivisuutta veressä sydämen ja keuhkojen kirurgisten toimenpiteiden aikana, koska se voi toimia indikaattorina kehon mukautumiskyvystä sekä hoidon aikana hiilihappoanhydraasin estäjillä - hypotiatsidilla, diakarbilla.

Hiilihappoanhydraasin aktiivisuuden määrittämiseen käytetään radiologisia, immunoelektroforeettisia, kolorimetrisiä ja titrimetrisiä menetelmiä. Määritys tehdään kokoverestä, joka on otettu hepariinin kanssa, tai hemolysoiduista punasoluista. Kliinisiin tarkoituksiin hyväksyttävimmät kolorimetriset menetelmät hmäärittämiseen (esimerkiksi Brinkman-menetelmän modifikaatiot), jotka perustuvat sen ajan määrittämiseen, joka tarvitaan inkubointiseoksen pH:n siirtämiseen arvosta 9,0 arvoon 6,3 CO 2 -hydraation seurauksena. . Hiilidioksidilla kyllästetty vesi sekoitetaan indikaattoripuskuriliuokseen ja tiettyyn määrään veriseerumia (0,02 ml) tai hemolysoituneiden punasolujen suspensio. Fenolipunaista käytetään indikaattorina. Kun hiilihappomolekyylit dissosioituvat, kaikki uudet CO 2 -molekyylit hydratoituvat entsymaattisesti. Vertailukelpoisten tulosten saamiseksi reaktion tulisi aina edetä samassa lämpötilassa, on kätevintä pitää sulavan jään lämpötila 0°:ssa. Kontrollireaktioaika (spontaani CO 2 -hydraation reaktio) on normaalisti 110-125 Kanssa. Normaalisti tällä menetelmällä määritettynä hiilihappoanhydraasin aktiivisuus on keskimäärin 2-2,5 tavanomaista yksikköä ja 1 miljoonassa punasolussa se on 0,458 ± 0,006 tavanomaista yksikköä (hyksikköä pidetään 2-kertainen nousu katalysoidun reaktion nopeudessa).

Bibliografia: Laboratoriokokeiden kliininen arviointi, toim. HYVIN. Titsa, per. englannista, s. 196, M., 1986.

Laskimoverestä voidaan uuttaa 55-58 tilavuusprosenttia hiilidioksidia. Suurin osa verestä uutetusta CO2:sta tulee plasmassa ja erytrosyyteissä olevista hiilihapposuoloista, ja vain noin 2,5 tilavuus-% hiilidioksidista liukenee ja noin 4-5 tilavuus-% yhdistyy hemoglobiiniin karbohemoglobiinin muodossa.

Hiilihappoa muodostuu hiilidioksidista punasoluissa, jotka sisältävät hiilihappoanhydraasientsyymiä, joka on voimakas katalyytti, joka nopeuttaa CO2:n hydraatioreaktiota.

Hiilidioksidin sitoutuminen veressä systeemisen ympyrän kapillaareissa. Kudoksissa muodostunut hiilidioksidi diffundoituu veren kapillaarien vereen, koska CO2-jännitys kudoksissa ylittää merkittävästi sen jännityksen valtimoveressä. Plasmaan liuennut CO2 diffundoituu punasoluihin, missä vaikutuksen alaisena hiilihappoanhydraasi se muuttuu välittömästi hiilihapoksi,

Laskelmien mukaan hiilihappoanhydraasin aktiivisuus erytrosyyteissä on sellainen, että hiilidioksidihydraation reaktio kiihtyy 1500-2000 kertaa. Koska kaikki punasolun sisällä oleva hiilidioksidi muuttuu hiilihapoksi, punasolun sisällä oleva CO2-jännite on lähellä nollaa, joten erytrosyyttiin pääsee yhä enemmän uusia määriä CO2:ta. Punasyytissä hiilihapon muodostuessa CO3:sta HCO3"-ionien pitoisuus kasvaa ja ne alkavat diffundoitua plasmaan. Tämä on mahdollista, koska punasolun pintakalvo on anioneja läpäisevä. Kationien kohdalla punasolu kalvo on käytännössä läpäisemätön HCO3"-ionien sijaan punasolu-ioni tulee klooriin Kloori-ionien siirtyminen plasmasta erytrosyyttiin vapauttaa plasmassa olevia natriumioneja, jotka sitovat punasoluun tulevat HCO3-ionit muodostaen NaHCO3:a Laskimoveriplasman kemiallinen analyysi osoittaa sen merkittävän lisääntyneen bikarbonaatin.

Anionien kerääntyminen punasolun sisään johtaa osmoottisen paineen nousuun erytrosyytin sisällä, mikä aiheuttaa veden kulkeutumisen plasmasta punasolun pintakalvon läpi. Tämän seurauksena punasolujen tilavuus systeemisissä kapillaareissa kasvaa. Hematokriittiä käyttävä tutkimus paljasti, että punasolut vievät 40 % valtimoveren tilavuudesta ja 40,4 % laskimoveren tilavuudesta. Tästä seuraa, että laskimoveren erytrosyyttien tilavuus on suurempi kuin valtimoiden punasolujen tilavuus, mikä selittyy veden tunkeutumisella niihin.

Samanaikaisesti hiilidioksidin pääsyn erytrosyyttiin ja hiilihapon muodostumisen kanssa oksihemoglobiinista vapautuu happea ja muuttuu pelkistetyksi hemoglobiiniksi. Jälkimmäinen on paljon vähemmän dissosioituva happo kuin oksihemoglobiini ja hiilihappo. Siksi, kun oksihemoglobiini muuttuu hemoglobiiniksi, H2CO3 syrjäyttää kaliumionit hemoglobiinista ja muodostaa niiden kanssa bikarbonaatin kaliumsuolan.

Vapautunut hiilihapon H˙-ioni sitoutuu hemoglobiiniin. Koska alentunut hemoglobiini on hieman dissosioitunut happo, veri ei happamoi ja pH-ero laskimo- ja valtimoveren välillä on erittäin pieni. Kudoskapillaarien punasoluissa tapahtuva reaktio voidaan esittää seuraavasti:

KHbO2 + H2CO3= HHb + O2 + KHSO3

Edellä olevasta seuraa, että oksihemoglobiini, muuttuen hemoglobiiniksi ja luovuttaen siihen liittyvät emäkset hiilidioksidiksi, edistää bikarbonaatin muodostumista ja hiilidioksidin kulkeutumista tässä muodossa. Lisäksi gcmoglobiini muodostaa kemiallisen yhdisteen CO2 - karbohemoglobiinin kanssa. Hemoglobiinin ja hiilidioksidin esiintyminen veressä määritettiin seuraavalla kokeella. Jos kokovereen lisätään kaliumsyanidia, joka inaktivoi hiilihappoanhydraasin täysin, käy ilmi, että tällaisen veren punasolut sitovat enemmän CO2:ta kuin plasma. Tästä pääteltiin, että erytrosyyttien CO2:n sitoutuminen hiilihappoanhydraasin inaktivoinnin jälkeen selittyy hemoglobiiniyhdisteen läsnäololla CO2:n kanssa punasoluissa. Myöhemmin havaittiin, että CO2 kiinnittyy hemoglobiinin amiiniryhmään muodostaen niin sanotun karbamiinisidoksen.

Karbohemoglobiinin muodostumisreaktio voi mennä suuntaan tai toiseen riippuen veren hiilidioksidin jännityksestä. Vaikka pieni osa verestä uutettavasta hiilidioksidin kokonaismäärästä yhdistetään hemoglobiiniin (8-10 %), tämän yhdisteen rooli hiilidioksidin kuljettamisessa veressä on melko suuri. Noin 25-30 % veren imemästä hiilidioksidista systeemisissä kapillaareissa yhdistyy hemoglobiiniin muodostaen karbohemoglobiinia.

CO2:n vapautuminen veren kautta keuhkojen kapillaareissa. Koska CO2:n osapaine alveolaarisessa ilmassa on pienempi kuin sen jännitys laskimoveressä, hiilidioksidi kulkee diffuusion kautta keuhkokapillaarien verestä keuhkorakkuloiden ilmaan. Veren CO2-paine laskee.

Samaan aikaan, koska alveolaarisessa ilmassa on korkeampi hapen osapaine verrattuna sen jännitykseen laskimoveressä, happea virtaa alveolaarisesta ilmasta keuhkojen kapillaarien vereen. Veren O2-paine kasvaa ja hemoglobiini muuttuu oksihemoglobiiniksi. Koska jälkimmäinen on happo, jonka dissosiaatio on paljon korkeampi kuin hiilihappohemoglobiinin, se syrjäyttää hiilihapon kaliumhaposta. Reaktio menee seuraavasti:

ННb + O2 + KНSO3= KНbO2+H2CO3

Hiilihappo, joka on vapautettu sidoksestaan ​​emästen kanssa, hajoaa hiilihappoanhydraasin vaikutuksesta hiilidioksidiksi vedeksi. Hiilihappoanhydraasin merkitys hiilidioksidin vapautumiselle keuhkoissa näkyy seuraavista tiedoista. Veteen liuenneen H2CO3:n dehydraatioreaktio, jossa muodostuu hiilidioksidia, joka poistuu verestä sen ollessa keuhkojen kapillaareissa, kestää 300 sekuntia. Veri kulkee keuhkojen kapillaarien läpi 1-2 sekunnissa, mutta tänä aikana hiilihapon dehydraatio punasolujen sisällä ja tuloksena olevan CO2:n diffuusio ensin veriplasmaan ja sitten alveolaariseen ilmaan.

Koska punasolujen HCO3-ionien pitoisuus pienenee keuhkojen kapillaareissa, nämä ionit plasmasta alkavat diffundoitua punasoluihin ja kloori-ionit diffundoituvat punasoluista plasmaan. Koska hiilidioksidin jännitys keuhkokapillaarien veressä vähenee, karbamiinisidos katkeaa ja karbohemoglobiini vapauttaa hiilidioksidia.

Veren hiilihappoyhdisteiden dissosiaatiokäyrät. Kuten olemme jo todenneet, yli 85 % hiilidioksidista, joka voidaan uuttaa verestä happamoittamalla, vapautuu bikarbonaattien (kalium punasoluissa ja natrium plasmassa) hajoamisen seurauksena.

Hiilidioksidin sitoutuminen ja vapautuminen vereen riippuu sen osittaisesta jännityksestä. Veren hiilidioksidiyhdisteille on mahdollista muodostaa dissosiaatiokäyrät, jotka ovat samanlaisia ​​kuin oksihemoglobiinin dissosiaatiokäyrät. Tätä varten vereen sitoutuneen hiilidioksidin tilavuusprosentit piirretään ordinaatta-akselille ja hiilidioksidin osajännitykset piirretään abskissa-akselille. Alempi käyrä kuvassa. 58 esittää hiilidioksidin sitoutumista valtimoveren toimesta, jonka hemoglobiini on lähes täysin kyllästetty hapella. Ylempi käyrä näyttää happaman kaasun sitoutumisen laskimoveren kautta.

Näiden käyrien korkeusero riippuu siitä, että oksihemoglobiinia sisältävän valtimoveren kyky sitoa hiilidioksidia on pienempi kuin laskimoveren. Koska oksihemoglobiini on hiilihappoa vahvempi happo, se poistaa emäksiä bikarbonaateista ja edistää siten hiilihapon vapautumista. Kudoksissa hemoglobiiniksi muuttuva oksihemoglobiini luovuttaa siihen liittyvät emäkset, mikä lisää happaman kaasun sitoutumista veressä.

Piste A alemmassa käyrässä kuvassa. 58 vastaa 40 mm Hg:n happojännitettä. Art., eli jännite, joka todella on valtimoveressä. Tällä jännitteellä sitoutuu 52 tilavuus-% CO2:ta. Ylemmän käyrän piste V vastaa happaman kaasun jännitettä 46 mmHg. Art., eli se on todella läsnä laskimoveressä. Kuten käyrästä voidaan nähdä, tällä jännitteellä laskimoveri sitoo 58 tilavuusprosenttia hiilidioksidia. Ylemmän ja alemman käyrän yhdistävä AV-viiva vastaa niitä hiilidioksidin sitomiskyvyn muutoksia, jotka tapahtuvat, kun valtimoveri muuttuu laskimoveri tai päinvastoin laskimoveri valtimoksi.

Laskimoveri vapauttaa keuhkojen kapillaareissa noin 6 tilavuusprosenttia CO2:ta, koska sen sisältämä hemoglobiini muuttuu oksihemoglobiiniksi. Jos hemoglobiinia keuhkoissa ei muutettu oksihemoglobiiniksi, niin, kuten käyrästä voidaan nähdä, laskimoveri, jonka hiilidioksidin osapaine alveoleissa on 40 mm Hg. Art. sitoisi 54 tilavuusprosenttia CO2:ta, joten luovuttaisi ei 6, vaan vain 4 tilavuusprosenttia. Samoin, jos systeemisen ympyrän kapillaareissa oleva valtimoveri ei luovuttanut happeaan, eli jos sen hemoglobiini pysyi kyllästettynä hapella, niin tämä valtimoveri kehon kapillaareissa olevan hiilidioksidin osapaineessa kudoksia, ei pystyisi sitomaan 58 tilavuusprosenttia CO2:ta, mutta vain 55 tilavuusprosenttia.

Työn tarkoituksena on selvittää sinkkipitoisen hiilihappoanhydraasin aktiivisuuteen vaikuttavia tekijöitä urosrottien lisääntymisjärjestelmässä matalan intensiteetin mikroaaltosäteilyn olosuhteissa. Hiilianhydraasilla on tärkeä rooli siemenplasman aineenvaihdunnassa ja siittiöiden kypsymisessä. Hiilianhydraasiaktiivisuus kontrolliryhmän rottien lisäkives- ja kiveksissä vesi-suolauutteissa vaihtelee tietojemme mukaan välillä 84,0 ± 74,5 U/ml, mikä kudoksen painona mitattuna on 336,0 ± 298,0 U/mg. Sinkki- ja polyamiini-ionien pitoisuuden ja hiilihappoanhydraasin aktiivisuuden välistä suhdetta tutkittiin. Hiilihappoanhydraasin aktiivisuudella urosrottien lisääntymisjärjestelmässä on monimutkainen säätelyjärjestelmä, joka ei tietenkään rajoitu kuvaamiimme tekijöihin. Saatujen tulosten perusteella voidaan päätellä, että tämän entsyymin aktiivisuuden eri säätelijöiden rooli vaihtelee riippuen hasteesta. On todennäköistä, että korkeat spermiinipitoisuudet rajoittavat hiilihappoanhydraasigeenin transkriptiota, kun otetaan huomioon tiedot tämän polyamiinin toiminnoista. Spermidiini toimii todennäköisesti rajoittavana tekijänä hsäätelyn post-tribosomaalisissa vaiheissa, ja putreskiini ja sinkki-ionien pitoisuus ovat toisiinsa liittyviä aktivaatiotekijöitä.

urosrottien lisääntymisjärjestelmä

sinkki-ionipitoisuus

polyamiinit

hiilihappoanhydraasi

1. Boyko O.V. Metodologiset näkökohdat suolahapon spermiinin ja spermidiinin käytöstä uropatogeenisen mikroflooran tunnistamiseen / O.V. Boyko, A.A. Terentjev, A.A. Nikolaev // Lisääntymisongelmat. – 2010. – nro 3. – s. 77-79.

2. Ilyina O.S. Ihmisveren sinkkipitoisuuden muutokset tyypin I diabeteksessa ja sinkkiä sisältävän insuliini-kondroitiinisulfaattikompleksin hypoglykeemisen vaikutuksen ominaisuudet: abstrakti. dis. ... cand. biol. Sci. – Ufa, 2012. – 24 s.

3. Lutsky D.L. Eri hedelmällisyyden omaavien ejakulaattien proteiinispektri / D.L. Lutsky, A.A. Nikolaev, L.V. Lozhkina // Urologia. – 1998. – nro 2. – s. 48-52.

4. Nikolaev A.A. Spermoplasmisten entsyymien aktiivisuus eri hedelmällisyyden siemensyöksyissä / A.A. Nikolaev, D.L. Lutsky, V.A. Bochanovsky, L.V. Lozhkina // Urologia. – 1997. – nro 5. – s. 35.

5. Ploskonos M.V. Polyamiinien määritys erilaisissa biologisissa esineissä / M.V. Ploskonos, A.A. Nikolaev, A.A. Nikolaev // Astrahanin osavaltio. hunaja. akad. – Astrakhan, 2007. – 118 s.

6. Polunin A.I. Sinkin käyttö miesten hedelmällisyyden hoidossa / A.I. Polunin, V.M. Miroshnikov, A.A. Nikolaev, V.V. Dumchenko, D.L. Lutsky // Mikroelementit lääketieteessä. – 2001. – T. 2. – Nro 4. – S. 44-46.

7. Haggis G.C., Gortos K. Urosrottien lisääntymiskanavakudosten hiilihappoanhydraasiaktiivisuus ja sen suhde siemennesteen tuotantoon // J. Fert. Reprod. – 2014. – V. 103. – s. 125-130.

Tiedetään, että sinkkiä sisältävän hiilihappoanhydraasin aktiivisuus on korkea uroslintujen, nisäkkäiden ja ihmisten lisääntymisjärjestelmässä. Tämän entsyymin aktiivisuus vaikuttaa siittiöiden kypsymiseen, niiden lukumäärään ja siittiöiden tilavuuteen. Mutta ei ole tietoa hmuutoksista lisääntymisjärjestelmän muiden vakiokomponenttien, kuten sinkki-ionien ja polyamiinien (putreskiini, spermiini ja spermidiini), vaikutuksesta, jotka vaikuttavat aktiivisesti spermatogeneesiin. Vain yleinen kuvaus hmuutosten seurauksista urosrottien lisääntymisjärjestelmän elinten morfofunktionaaliseen tilaan, siittiöiden lukumäärään ja niiden liikkuvuuteen on annettu.

Työmme tarkoitus oli tutkimus sinkkiä sisältävän hiilihappoanhydraasin aktiivisuudesta ja sen yhteydestä polyamiinien ja sinkki-ionien tasoon sukukypsien urosrottien lisääntymisjärjestelmän kudoksissa.

Materiaalit ja menetelmät. Tutkimuksen kokeellisessa osassa oli 418 urospuolista valkoista Wistar-rottaa. Rotat olivat 6-7 kuukauden ikäisiä (kypsiä yksilöitä). Rottien ruumiinpaino oli 180-240 g normaaleissa vivarium-olosuhteissa pidettynä. Kaikki tutkimukset tehtiin vuoden syys-talvikaudella, jotta vältetään kausivaihteluiden vaikutus kokeellisiin vaikutuksiin. Rottien kivekset ja lisäkivekset kerättiin eetterianestesiassa (kokeelliset tutkimukset suoritettiin tiukasti Helsingin julistuksen eläinten inhimillisestä kohtelusta).

Tutkimuksemme kohteina olivat sukukypsien valkoisten urosrottien lisäkiveksen ja kiveksen vesi-suolauutteet. Uutteet valmistettiin Tris-suolahappopuskurissa pH = 7,6 paino/tilavuussuhteessa 1/5, neljä kertaa jäädytyksen, sulatuksen ja sentrifugoinnin jälkeen 8000 g 50 minuuttia, näytteet pakastettiin ja säilytettiin -24 °C:ssa kunnes tutkimus.

Sinkin määritys. 2 ml:aan tutkittavaa uutetta lisättiin 0,1 ml 10-prosenttista NaOH:ta ja 0,2 ml dititsonin 1-prosenttista liuosta hiilitetrakloridissa. Negatiiviseen kontrolliin lisättiin 2 ml tislattua vettä, positiiviseen kontrolliin - 2 ml 20 μmol sinkkisulfaattiliuosta (standardinkkisulfaattiliuoksen molaarinen pitoisuus). Näytteet fotometrittiin 535 nm:ssä. Näytteen sinkkikationien pitoisuus laskettiin käyttämällä kaavaa: CZn=20 µmol × Näyte OD535/Standard OD535, jossa Näyte OD535 on näytteen optinen tiheys mitattuna aallonpituudella 535 nm; OD535 Standard - 20 mikromolaarisen sinkkisulfaatin standardiliuoksen optinen tiheys mitattuna aallonpituudella 535 nm.

Hiilihappoanhydraasin määritys. Menetelmä perustuu bikarbonaattidehydraation reaktioon dehydraation seurauksena syntyneen hiilidioksidin poiston kanssa reaktioväliaineen intensiivisellä kuplittamisella hiilimonoksidista vapautetulla ilmalla ja samanaikaiseen pH:n muutosnopeuden rekisteröintiin. Reaktio aloitetaan lisäämällä nopeasti substraatti - natriumbikarbonaattiliuos (10 mM) testinäytteen sisältävään reaktioseokseen. Tässä tapauksessa pH nousee 0,01-0,05 yksikköä. Näytteet (10,0-50,0 mg) sukukypsien valkoisten urosrottien lisäkivestä ja kiveksistä homogenisoitiin ja sentrifugoitiin 4500 g:ssä 30 minuuttia. 4 °C:ssa ja supernatantti laimennetaan kahdesti tislatulla vedellä 4 °C:ssa tilavuuteen, joka mahdollistaa reaktioajan mittaamisen. Hiilianhydraasiaktiivisuus määräytyy alkuperäisen pH-arvon muutoksella 8,2:sta 8,7:ään CO2-dehydraatioreaktiossa. Hydroksyyli-ionien kertymisnopeus mitataan elektrometrisesti käyttämällä herkkää ohjelmoitavaa pH-mittaria (InoLab pH 7310), joka on liitetty PC:hen. pH-muutos 8,2:sta 8,7:ään ajan funktiona lineaarisessa osassa ottaa huomioon entsyymiaktiivisuuden. Keskimääräinen aika (T) neljälle mittaukselle laskettiin. Kontrolliksi otettiin pH-muutosaika C02:n spontaanin hydratoitumisen aikana väliaineessa ilman näytettä. Hiilianhydraasiaktiivisuus ilmaistiin entsyymiyksiköinä (U) per mg märkää kudosta seuraavan yhtälön mukaisesti: ED = 2 (T0 - T)/ (T0 × mg kudosta reaktioseoksessa), jossa T0 = keskimääräinen aika 4 mittaukselle puhdas liuos, jossa on 4 ml jäähdytettyä, kylläistä hiilidioksidia, kaksi kertaa tislattua vettä.

Polyamiinien määritys. Näytteet (100-200 mg) kypsien urosalbiinorottien lisäkiveksestä ja kiveksistä homogenisoitiin, suspendoitiin 1 ml:aan 0,2-normaalia perkloorihappoa vapaiden polyamiinien uuttamiseksi ja sentrifugoitiin. 100 µl:aan supernatanttia lisättiin 110 µl 1,5 M natriumkarbonaattia ja 200 µl dansyylikloridia (7,5 mg/ml liuos asetonissa; Sigma, München, Saksa). Lisäksi 10 µl 0,5 mM diaminoheksaania lisättiin sisäiseksi standardiksi. 1 tunnin inkuboinnin jälkeen 60 °C:ssa pimeässä, 50 µl proliiniliuosta (100 mg/ml) lisättiin sitomaan vapaa dansyylikloridi. Sitten polyamiinien dansyylijohdannaiset (tästä eteenpäin nimitetään DNSC-polyamiineja) uutettiin tolueenilla, sublimoitiin tyhjiöhaihduttimessa ja liuotettiin metanoliin. Kromatografia suoritettiin käänteisfaasi-LC 18 -kolonnilla (Supelco), korkean suorituskyvyn nestekromatografiajärjestelmässä (Dionex), joka koostui gradienttisekoittimesta (malli P 580), automaattisesta injektorista (ASI 100) ja fluoresenssidetektorista (RF 2000). . Polyamiinit eluoitiin lineaarisessa gradientissa 70 %:sta 100 %:iin (v/v) metanolia vedessä virtausnopeudella 1 ml/min ja havaittiin viritysaallonpituudella 365 nm ja emissioaallonpituudella 510 nm. Tiedot analysoitiin Dionex Chromeleon -ohjelmistolla ja kvantifiointi suoritettiin kalibrointikäyrillä, jotka saatiin puhtaiden aineiden seoksesta (kuva A).

DNSC-polyamiinien korkean suorituskyvyn kromatografia:

A - DNSC-polyamiinien standardiseoksen kromatogrammi; B - DNSC-polyamiinien kromatogrammi yhdestä urosrottien lisäkiveksen ja kivesten kudosnäytteistä. 1 - putreskiini; 2 - cadaveriini; 3 - heksaanidiamiini (sisäinen standardi); 4 - spermidiini; 5 - siittiöitä. X-akseli on aika minuutteina, y-akseli on fluoresenssi. Numeroimattomat piikit – tunnistamattomat epäpuhtaudet

Tutkimustuloksia ja keskustelua. Kuten tiedetään, hiilihappoanhydraasilla on tärkeä rooli siemenplasman metaboliassa ja siittiöiden kypsymisessä. Hiilianhydraasiaktiivisuus kontrolliryhmän rottien lisäkives- ja kiveksissä vesi-suolauutteissa vaihtelee tietojemme mukaan välillä 84,0 ± 74,5 U/ml, mikä kudoksen painona mitattuna on 336,0 ± 298,0 U/mg. Entsyymin korkea aktiivisuus voidaan selittää sen tärkeällä fysiologisella roolilla. Vertailun vuoksi voidaan todeta, että tämän entsyymin aktiivisuus samojen eläinten muissa kudoksissa on paljon alhaisempi (taulukko 1), paitsi kokoveressä, jossa tiedetään korkea erytrosyyttien hiilihappoanhydraasin aktiivisuus. Huomionarvoista on kuitenkin harvojen erittäin laaja hajonta lisäkiveksissä ja kiveksissä, joiden variaatiokerroin on yli 150 % (taulukko 1).

pöytä 1

Hiilianhydraasin aktiivisuus sukukypsien miesten kudoksissa

Tämä osoittaa huomioimattomien tekijöiden vaikutuksen entsyymiaktiivisuuteen. On olemassa kaksi seikkaa, jotka selittävät tämän ominaisuuden. Ensinnäkin tiedetään, että biologisesti aktiiviset amiinit, mukaan lukien polyamiinit spermidiini ja spermiini, kykenevät aktivoimaan hiilihappoanhydraasia. Se on miehen lisääntymisjärjestelmä, joka on rikkain spermiinin ja spermidiinin lähde. Siksi suoritimme rinnakkaisen polyamiinipitoisuuden määrityksen urosrottien lisäkives- ja kiveksissä olevasta vesi-suolauutteesta. Polyamiinit spermidiini, spermiini ja putreskiini analysoitiin HPLC:llä, kuten on kuvattu kohdassa Menetelmät. Osoitettiin, että spermiiniä, spermidiiniä ja putreskiinia havaittiin urosrottien lisäkiveskudoksessa ja kiveksissä (kuvio B).

Terveillä seksuaalisesti kypsillä urosrotilla spermiinitaso oli 5,962±4,0,91 µg/g kudosta, spermidiiniä 3,037±3,32 µg/g kudosta, putreskiinia 2,678±1,82 µg/g kudosta ja spermiini/spermidiini-suhde 1,88. Lisäksi tietojemme mukaan sekä spermidiinitaso että spermiinitaso (vähemmässä määrin) ovat alttiina merkittäville vaihteluille. Korrelaatioanalyysi osoitti merkittävän positiivisen suhteen (r=+0,3) spermiinin ja spermidiinin sekä vastaavasti spermidiinin ja putressiinin (r=+0,42) välillä. Ilmeisesti tämä seikka on yksi niistä tekijöistä, jotka vaikuttavat hmääritystulosten suureen hajaantumiseen.

Toinen hsäätelijä voi olla sinkin taso sukukypsien urosrottien lisääntymiskudoksessa. Tietojemme mukaan sinkki-ionipitoisuus vaihtelee suuresti, 3,2 - 36,7 μg/g kudosta sukukypsien urosrottien kivesten ja lisäkiveksen kokonaisvalmisteesta.

Sinkkitasojen korrelaatioanalyysi spermiini-, spermidiini- ja hiilihkanssa osoitti erilaisia ​​positiivisia korrelaatiotasoja sinkki-ionien ja näiden metaboliittien pitoisuuden välillä. Spermiinin kanssa havaittiin merkityksetön assosiaatiotaso (+0,14). Kun otetaan huomioon käytettyjen havaintojen määrä, tämä korrelaatio ei ole merkitsevä (p≥0,1). Merkittävä positiivinen korrelaatio havaittiin sinkki-ionien tason ja putreskiinipitoisuuden (+0,42) ja spermidiinipitoisuuden (+0,39) välillä. Sinkki-ionien pitoisuuden ja hvälillä havaittiin myös odotetusti korkea positiivinen korrelaatio (+0,63).

Seuraavassa vaiheessa yritimme yhdistää sinkin pitoisuutta ja polyamiinien määrää hsäätelevinä tekijöinä. Analysoitaessa sinkki-ionien, polyamiinien ja hyhteismäärityksen variaatiosarjoja paljastui joitain säännönmukaisuuksia. Osoitettiin, että 69:stä htasolla tehdystä tutkimuksesta voidaan erottaa kolme ryhmää:

Ryhmä 1 - korkea aktiivisuus 435 - 372 yksikköä (havaintoja 37),

Ryhmä 2 - alhainen aktiivisuus 291 - 216 yksikköä (havaintoja 17),

Ryhmä 3 - erittäin alhainen aktiivisuus 177 - 143 yksikköä (havaintoja 15).

Polyamiinien tasoja ja sinkki-ionien pitoisuuksia luokittelussa näiden ryhmien kanssa paljastui mielenkiintoinen piirre, joka ei tullut esiin variaatiosarjoja analysoitaessa. Spermiinin maksimipitoisuudet (keskimäärin 9,881 ± 0,647 μg/g kudosta) liittyvät kolmanteen havaintoryhmään, jolla on erittäin alhainen hiilihappoanhydraasiaktiivisuus, ja minimi (keskimäärin 2,615 ± 1,130 μg/g kudosta) toiseen ryhmään, jolla on alhainen aktiivisuus. entsyymiaktiivisuus.

Suurin määrä havaintoja liittyy ensimmäiseen ryhmään, jossa on korkea hiilihappoanhydraasiaktiivisuus, tässä ryhmässä spermiinipitoisuudet ovat lähellä keskimääräisiä arvoja (keskimäärin 4,675 ± 0,725 μg/g kudosta).

Sinkki-ionien konsentraatiolla on monimutkainen suhde hiilihappoanhydraasin aktiivisuuteen. Ensimmäisessäyhmässä (taulukko 2) sinkki-ionien pitoisuus on myös korkeampi kuin muiden ryhmien arvot (keskimäärin 14,11±7,25 μg/g kudosta). Lisäksi sinkki-ionien pitoisuus laskee hvähenemisen mukaisesti, mutta tämä lasku ei ole verrannollinen. Jos toisessa ryhmässä hiilihappoanhydraasin aktiivisuus laskee ensimmäiseen verrattuna 49,6 % ja kolmannessa 60,35 %, niin sinkki-ionien pitoisuus laskee toisessa ryhmässä 23 % ja kolmannessa 39 %.

taulukko 2

Polyamiinien ja sinkki-ionien pitoisuuden ja hiilihappoanhydraasin aktiivisuuden välinen suhde

Tämä osoittaa lisätekijöitä, jotka vaikuttavat tämän entsyymin aktiivisuuteen. Putreskiinipitoisuuden dynamiikka näyttää hieman erilaiselta (taulukko 2). Tämän polyamiinin taso laskee kiihtyvällä vauhdilla ja kolmannessa vertailuryhmässä putreskiinin taso on keskimäärin lähes 74 % alhaisempi. Spermidiinitason dynamiikka eroaa siinä, että tämän polyamiinin "hyppy" pitoisuusarvot liittyvät ensisijaisesti toiseen hiilihryhmään. Tämän entsyymin korkealla aktiivisuudella (ryhmä 1) spermidiinipitoisuus on hieman korkeampi kuin kaikkien havaintojen keskiarvo, ja kolmannessa ryhmässä se on lähes 4 kertaa pienempi kuin toisen ryhmän pitoisuus.

Siten hiilihappoanhydraasin aktiivisuudella urosrottien lisääntymisjärjestelmässä on monimutkainen säätelyjärjestelmä, joka ei ilmeisesti rajoitu kuvaamiimme tekijöihin. Saatujen tulosten perusteella voidaan päätellä, että tämän entsyymin aktiivisuuden eri säätelijöiden rooli vaihtelee riippuen hasteesta. On todennäköistä, että korkeat spermiinipitoisuudet rajoittavat hiilihappoanhydraasigeenin transkriptiota, kun otetaan huomioon tiedot tämän polyamiinin toiminnoista. Spermidiini toimii todennäköisesti rajoittavana tekijänä hsäätelyn post-tribosomaalisissa vaiheissa, ja putreskiini ja sinkki-ionien pitoisuus ovat toisiinsa liittyviä aktivaatiotekijöitä.

Näissä olosuhteissa ulkoisten tekijöiden (mukaan lukien lisääntymistoimintoja muuttavien) vaikutusten arvioiminen hiilihappoanhydraasin aktiivisuuteen, joka on yksi tärkeimmistä linkkeistä urosnisäkkäiden lisääntymisjärjestelmän aineenvaihdunnassa, tulee paitsi tärkeäksi myös melko tärkeäksi. monimutkainen prosessi, joka vaatii useita tarkastuksia ja monenvälistä arviointia.

Bibliografinen linkki

Tuomme huomionne "Luonnontieteiden Akatemian" kustantajan julkaisemat lehdet

Joita paradoksaalisesti ei käytetä itsenäisesti diureetteina (diureetteina). Hiilihappoanhydraasin estäjiä käytetään pääasiassa glaukoomaan.

Nefronin proksimaalisten tubulusten epiteelissä oleva hiilihappoanhydraasi katalysoi hiilihapon dehydraatiota, joka on keskeinen linkki bikarbonaattien takaisinimeytymisessä. Kun hiilihappoanhydraasin estäjät vaikuttavat, natriumbikarbonaatti ei imeydy takaisin, vaan se erittyy virtsaan (virtsa muuttuu emäksiseksi). Natriumin jälkeen kalium ja vesi erittyvät kehosta virtsan mukana. Tämän ryhmän aineiden diureettinen vaikutus on heikko, koska lähes kaikki proksimaalisissa tubuluksissa virtsaan vapautunut natrium jää nefronin distaalisiin osiin. Siksi Hiilihappoanhydraasin estäjiä ei tällä hetkellä käytetä itsenäisesti diureetteina..

Hiilianhydraasin estäjälääkkeet

Asetatsolamidi

(diakarbi) on tämän diureettiryhmän tunnetuin edustaja. Se imeytyy hyvin maha-suolikanavasta ja muuttumattomana erittyy nopeasti virtsaan (eli sen vaikutus on lyhytaikainen). Asetatsolamidin kaltaiset lääkkeet - dikloorifenamidi(daranid) ja metatsolamidi(neptatsaani).

Metatsolamidi kuuluu myös hiilihappoanhydraasin estäjien luokkaan. Sillä on pidempi puoliintumisaika kuin asetatsolamidilla ja se on vähemmän nefrotoksinen.

Dortsolamidi. Indikoitu kohonneen silmänpaineen alentamiseen potilailla, joilla on avokulmaglaukooma tai silmän verenpainetauti ja jotka eivät reagoi riittävästi beetasalpaajiin.

brintsolamidi(tuotenimet Azopt, Alcon Laboratories, Inc, Befardin Fardi MEDICALS) kuuluu myös hiilihappoanhydraasin estäjien luokkaan. Käytetään alentamaan silmänpainetta potilailla, joilla on avokulmaglaukooma tai silmän verenpaine. Brintsolamidin ja timololin yhdistelmää käytetään aktiivisesti markkinoilla kauppanimellä Azarga.

Sivuvaikutukset

Hiilihappoanhydraasin estäjillä on seuraavat tärkeimmät sivuvaikutukset:

• hypokalemia;
• hyperkloreeminen metabolinen asidoosi;
• fosfaturia;
• hyperkalsiuria, johon liittyy munuaiskivien riski;
• neurotoksisuus (parestesia ja uneliaisuus);
• allergiset reaktiot.

Vasta-aiheet

Asetatsolamidi, kuten muutkin hiilihappoanhydraasin estäjät, on vasta-aiheinen maksakirroosissa, koska virtsan alkalisointi estää ammoniakin vapautumisen, mikä johtaa enkefalopatiaan.

Käyttöaiheet

Hiilihappoanhydraasin estäjiä käytetään ensisijaisesti glaukooman hoitoon. Niitä voidaan käyttää myös epilepsian ja akuutin vuoristotaudin hoitoon. Koska ne edistävät virtsahapon liukenemista ja poistumista, niitä voidaan käyttää kihdin hoidossa.

Asetatsolamidi käytetään seuraavissa olosuhteissa:

• Glaukooma (vähentää silmänsisäisen nesteen tuotantoa sädekehän suonipunoksen toimesta.
• Epilepsian (petit mal) hoito. Asetatsoliamidi on tehokas useimpien kohtausten hoidossa, mukaan lukien toonis-klooniset ja poissaolokohtaukset, vaikka siitä on vain vähän hyötyä, koska toleranssi kehittyy pitkäaikaisessa käytössä.
• Nefropatian ehkäisyyn hoidon aikana, koska solujen hajoaminen vapauttaa suuren määrän puriiniemäksiä, jotka lisäävät jyrkästi virtsahapon synteesiä. Virtsan alkalisointi asetatsolamidilla bikarbonaattien vapautumisen vuoksi estää virtsahappokiteiden häviämisen aiheuttamaa nefropatiaa.
• Diureesin lisäämiseen turvotuksen aikana ja metabolisen hypokloreemisen alkaloosin korjaamiseen CHF:ssä. Vähentämällä NaCl:n ja bikarbonaattien reabsorptiota proksimaalisissa tubuluksissa.

Mikään näistä käyttöaiheista ei kuitenkaan ole asetatsolamidi ensisijainen farmakologinen hoito (valittu lääke). Asetatsoliamidia määrätään myös vuoristotautiin (koska se aiheuttaa asidoosia, joka johtaa hengityskeskuksen herkkyyden palautumiseen hypoksialle).

Hiilihappoanhydraasin estäjät vuoristotaudin hoidossa

Suurilla korkeuksilla hapen osapaine on alhaisempi, ja ihmisten on hengitettävä nopeammin saadakseen tarpeeksi happea elääkseen. Kun näin tapahtuu, hiilidioksidin CO2 osapaine keuhkoissa laskee (yksinkertaisesti puhalletaan ulos uloshengitettäessä), mikä johtaa hengitysalkaloosiin. Tämä prosessi yleensä kompensoituu munuaisissa bikarbonaatin erittymisen kautta ja aiheuttaa siten kompensoivan metabolisen asidoosin, mutta tämä mekanismi kestää useita päiviä.

Suorempi hoito on hiilihappoanhydraasin estäjät, jotka estävät bikarbonaatin imeytymistä munuaisiin ja auttavat korjaamaan alkaloosia. Hiilihappoanhydraasin estäjät parantavat myös kroonista vuoristotautia.